Immunomodulacyjne i przeciwalergiczne działanie probiotyków Marian Krawczyński em. prof. UM w Poznaniu
b. kierownik I Katedry Pediatrii i Kliniki Gastroenterologii Dziecięcej i Chorób Metabolicznych


W ostatnich kilkunastu latach lawinowo rośnie liczba badań i publikacji na temat probiotyków i prebiotyków. Zdecydowana większość z nich przedstawia korzystne ich działanie w ostrych i przewlekłych stanach zapalnych przewodu pokarmowego, a zwłaszcza biegunkach rotawirusowych (RV) i poantybiotykowych. W ślad za nimi systematycznie na rynku pojawiają się nowe probiotyczne produkty farmaceutyczne i spożywcze zawierające probiotyki. Znacznie mniej badań, zwłaszcza klinicznych, dotyczy immunomodulacyjnego wpływu probiotyków lub ich roli prewencyjnej i leczniczej w stanach alergicznych lub atopii.

Idealny produkt (preparat) zawierający probiotyk powinien spełniać następujące warunki (kryteria):
• zawierać co najmniej 108 żywych bakterii pochodzenia ludzkiego na 1g preparatu (badania doświadczalne wskazują, że elementy bakterii probiotycznych mogą również być skuteczne),
• wykazywać zdolność adhezyjną do komórek nabłonka jelita i właściwości wzrostowe oraz kolonizować przewód pokarmowy (p.p.) gospodarza,
• wykazywać działanie przeciw drobnoustrojom patogennym,
• musi być bezpieczny i korzystnie oddziaływać na zdrowie człowieka.

Najczęściej stwierdzano pozytywne oddziaływanie następujących drobnoustrojów probiotycznych: Lactobacilli Bifidobacteriae produkujących kwas mlekowy (Isolauri i wsp., 2001) oraz Saccharomyces i niepatogenetycznych szczepów E.coli.

Pozytywny wpływ drobnoustrojów probitycznych zachodzi poprzez (Madaliński i Szajewska, 2004):
zakwaszanie treści jelita i negatywne oddziaływanie na bakterie chorobotwórcze,
zapobieganie kolonizacji bakterii chorobotwórczych na drodze konkurencji o receptory komórkowe,
konkurowanie z innymi drobnoustrojami o substancje odżywcze,
działanie cytoprotekcyjne, chroniące komórki przewodu pokarmowego (enterocyty, kolonocyty) przed czynnikami agresji,
modulowanie odporności komórkowej i humoralnej.

Immunologiczne działanie probiotyków wyraża się przede wszystkim wpływem na rozwój i dojrzewanie układu odpornościowego przewodu pokarmowego: GALT (Gut Associated Lymphoid Tissue) i MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue). Sterylny u noworodka p.p. początkowo jest kolonizowany przez E.coli pochodzenia matczynego, a następnie – Lactobacilli (Heavy i Rowland, 1999). U niemowląt karmionych piersią dominuje Bifidobacterium (Cukrowska i Czarnowska, 2007). Stopniowo, od 2. roku życia dziecka, kształtuje się złożony ekosystem jelitowy z przewagą beztlenowych Bacterioides, charakterystyczny dla dorosłych.

Mechanizm korzystnego oddziaływania immunologicznego gatunku Lactobacilli polega na modyfikowaniu mikroflory jelitowej przez:
negatywny wpływ na drobnoustroje patogenne,
ochronę bariery anatomicznej błony śluzowej przez zwiększenie wydzielania śluzu i normalizację przepuszczalności nabłonka jelitowego dla antygenów,
zwiększenie bariery immunologicznej przez oddziaływanie na komórki dendrytyczne (DC) systemu MALT (Ibnou-Zekri i wsp,2003, Strus i wsp., 2002). W regulacji cytokin pro- i przeciwzapalnych w wydzielinach błon śluzowych, z ukierunkowaniem na cytokiny Th1 i Th2 (Drakes i wsp. 2004, Christensen i wsp., 2002).

W badaniach doświadczalnych stwierdzono, że komórki dendrytyczne (DC) i komórki nabłonka jelitowego (EC) przy udziale szczepów Lactobacillus spp. regulują równowagę komórkową (Th1) i humoralną (Th2) odpowiedzi immunologicznej oraz tolerancję immunologiczną (Th3). Lactobacilli znajdujące się w preparatach probiotycznych hamują produkcję cytokin prozapalnych (TNF-alfa, Il-8, Il-12), a pobudzają – przeciwzapalnych (IGF-beta, Il-10). Tego rodzaju działanie wykazywały L.casei i L.bulgaricus, hamujące syntezę TNF-alfa i Il-8 w błonie śluzowej pacjentów z chorobą Leśniowskiego-Crohna. L.casei indukował ponadto syntezę Il-10 (Drakes i wsp.,2004, Hart i wsp., 2004). Spostrzeżenia te potwierdzają możliwość przeciwzapalnego działania probiotyków poprzez modulację immunologiczną.

Zróżnicowanie cytokin uwalnianych przez komórki DC stymulowane przez Lactobacillus zależy od szczepu probiotyku o właściwościach immunomodulacyjnych. Najprawdopodobniej jest ono uwarunkowane różnicami w budowie ściany komórkowej, zwłaszcza struktur będących ligandami dla receptorów TLR (tolllike receptor) (Rakoff-Nahoum i wsp., 2004). Pełnią one podstawową rolę w aktywacji układu immunologicznego. Istnieją dowody, że L.casei stymuluje syntezę czynnika neutralizującego TNF-alfa poprzez makrofagi, a L.johnsoni i L.acidophilus – hamują produkcję TNF-alfa, Il-8 i Il-12.

Immunologiczne działanie szczepów Lactobacillus jest zmienne. Aktywność immunologiczną Lactobacilli spp. wiąże się głównie z wpływem egzopolisacharydów (EPS). Oddziaływanie probiotyków na immunologiczną barierę jelitową zależy nie tylko od rodzaju szczepu bakteryjnego, ale także od dynamiki czynnościowej systemu MALT. Immunoregulacyjne działanie probiotyków zachodzi więc bezpośrednio i pośrednio przez ekosystem jelitowy.

Wpływ bakterii komensalnych (CAMP) i probiotycznych (PAMP) na rozwój układu GALT potwierdzono w badaniach doświadczalnych u zwierząt pozbawionych bakterii jelitowych. Wyrażał się on zwiększoną produkcją przeciwciał sekrecyjnych i krążących w klasie IgA i IgM oraz stymulowaniem nieswoistych mechanizmów odporności, ograniczającym przenikanie antygenów bakteryjnych i pokarmowych przez barierę jelitową (Cukrowska i wsp., 2002). Korzystny wpływ probiotyków E.coli Nissle 1917 na aktywność TLR-2 i TLR-4 potwierdzono również na mysim modelu doświadczalnym (Grabig i wsp., 2006).

Badania kliniczne kontrolowane placebo z podwójnie ślepą próbą wykonane przez Viljanena i wsp. (2005), u 230 niemowląt z AZS, w których stosowano Lactobacillus GG, w połączeniu z 3 innymi probiotykami, po 1 i 2 miesięcznej obserwacji wykazały korzystne oddziaływanie jedynie w grupie z podwyższonymi IgE. Nie uzyskano tego efektu u dzieci otrzymujących wyłącznie mieszaninę probiotyków. Również w badaniach Rosenfelda i wsp. (2003) warunek podwyższonego poziomu IgE okazał się niezbędny do uzyskania poprawy stanu klinicznego u dzieci z AZS w wieku 1-13 lat otrzymujących dwa probiotyki: Lactobacillus rhamnosus 190702 i Lactobacillus reuteri 122460.

Istnieją także spostrzeżenia o pozytywnych efektach stosowania probiotyków, zwłaszcza L.rhamnosus GG i L. rhamnosus LC705 w alergii pokarmowej u dzieci, prawdopodobnie poprzez normalizację flory jelitowej i przepuszczalności błony śluzowej, co skutkuje zmniejszeniem przenikania antygenów do jelita. W badaniach doświadczalnych wykazano możliwość immunologicznego wpływu nie tylko całej komórki bakterii probiotycznej, ale nawet jej fragmentu lub metabolitu (Kirjavainen i wsp., 2001).

Probiotyki mogą wpływać na komórki immunokompetentne tkanki limfatycznej jelit (działanie bezpośrednie) lub przez zmianę flory jelitowej i degradację antygenów pokarmowych. Zwiększenie produkcji interferonu gamma (INF-gamma) wskazuje na możliwość mniejszego odczynu zapalnego w atopii. Aktywność Il-12 przez makrofagi może aktywizować komórki Th1.

U dzieci z alergią na mleko krowie z IgE zależnym atopowym zapaleniem skóry (AZS), leczenie probiotycznym szczepem Lactobacillus GG wykazało wzrost IFNgamma (Pohjavuori i wsp., 2004) i limfocytów Treg oraz zwiększenie sekrecji Il-10, ze współistnieniem hamującego wpływu sekrecyjnego cytokin. L.casei aktywował produkcję cytokin przeciwzapalnych Il-12, TNF-alfa, IFN-gamma (Pessi i wsp.,2000) i hamował proalergiczną Il-5. W badaniach doświadczalnych u myszy wykazano, że na potencjalnie szkodliwe alergeny, Lactobacillus casei Shirota może zwiększać produkcję IgA w kępkach Peyera (Matzuzaki i wsp., 1998).

Podane łącznie L.casei i L.bulgaricus hamowały nadmierną produkcję prozapalnych TFN-alfa u dzieci z chorobą Leśniowskiego-Crohna (Borruel i wsp., 2002). Znane są również doniesienia (Pena i wsp., 2003), że Lactobacillus GG może zmniejszać odczyn zapalny w nieswoistym zapaleniu jelit (IBD – Infl ammatory Bowel Disease). Mechanizm tego działania polega na stymulacji produkcji cytokin przeciwzapalnych przez komórki prezentujące antygen lub zmniejszaniu produkcji TNF-alfa przez makrofagi.

Korzystny wpływ probiotyków na choroby alergiczne i zapalne wynika z ich wpływu na regulację równowagi pomiędzy cytokinami Th1/Th2.Działanie profilaktyczne potwierdzono u: L.ramnosus GG, E.coli 083.

Działania lecznicze wykazywały:
w AZS o podłożu atopowym: L.ramnosus 1970-2, L.reuteri, L.fermenticus, Bifidobacterium lacti,
w zapaleniu nieswoistym jelit: E.coli Nissle 1917 (wrzodziejące zapalenie jelita grubego), Saccharomyces boulardi (choroba Leśniowskiego-Crohna).

W AZS podstawowe znaczenie ma nieprawidłowa reakcja na antygen zewnętrzny, co wyraża się zaburzeniem mechanizmu regulującego tolerancję (Novak i wsp., 2003). U 3/4 pacjentów obserwowano podwyższenie antygenowości swoistej IgE, rzadziej (1/4 chorych) – pobudzenie prozapalnych limfocytów T oraz zaburzenie regulacyjnej czynności limfocytów Treg. Atopia nasilała procesy immunologiczne na komórkach dendrytycznych.

Bakterie p.p. modulują przede wszystkim rozwój i dojrzewanie układu immunologicznego. Zwiększona początkowo u noworodków aktywność cytokin Th2, uprzednio decydująca o utrzymaniu ciąży, ma zasadnicze znaczenie w patogenezie AZS. Stopniowo następuje ich eliminacja i regulacja równowagi Th1/Th2, głównie przez bakterie jelitowe i ich składowe, np. lipoproteidy i lipopolisacharydy, które aktywują receptory TLR na enterocytach i komórkach dendrytycznych (DC). Równowagę cytokinową warunkują limfocyty Treg oraz Il-10 i transformujący czynnik wzrostu TGF-beta.

Ciekawe spostrzeżenia poczynili Björnstein i wsp. (1999) u szwedzkich i estońskich dzieci z AZS przed 2. rokiem życia. Wykazali oni, że w porównaniu do dzieci zdrowych ich p.p. był słabiej skolonizowany. Poza tym u niemowląt fińskich, w porównaniu do estońskich, nastąpił spadek Bifidobacterium przy wzroście ilości Clostridium. Zmniejszenie zawartości Bifidobacterium w kale na korzyść Staphylococcus aureus u 7-letnich dzieci z objawami alergii zauważyli także Watanabe i wsp. (2003).

Cytowane badania wskazują na zależność między stanem mikroflory jelitowej, a układem odporności, a tym samym występowaniem chorób alergicznych. Noworodki urodzone z ciąż rozwiązanych cięciem cesarskim wykazywały opóźnioną kolonizację bakteryjną p.p.

W związku z bardziej sterylnymi warunkami wychowania dzieci w krajach rozwiniętych, tzw. hipoteza higieniczna tłumaczy również częstsze występowanie chorób alergicznych, w tym astmy - zmniejszoną stymulacją antygenową. Kalliomaki i wsp. (2007) wykazali, że podawanie Lactobacillus rhamnosus GG kobietom ciężarnym, pochodzącym z rodzin obciążonych atopią i ich dzieciom karmionym piersią, zmniejszyło o 50% występowanie AZS i alergiczne zapalenie spojówek. Po 4 latach u dzieci otrzymujących Lactobacillus GG częstość występowania AZS była nadal znacznie niższa. Trzeci etap tych długofalowych badań randomizowanych (Kalliomaki i wsp.,2007) kontynuowany u dzieci z rodzin atopowych do siódmego roku życia,. z końcowym 73% ich udziałem, wykazał dalsze zmniejszenie ryzyka występowania AZS (przy dodatnich testach skórnych). Tego efektu nie potwierdzono w alergicznym nieżycie nosa (ANN) i astmie. Podobne korzystne wyniki u dzieci z AZS uzyskali inni autorzy (Taylor i wsp, 2007; Abrahamson i wsp., 2007).

Podobnie zmniejszenie ryzyka wystąpienia AZS (wyłącznie) u dzieci do drugiego roku życia z rodzin obciążonych atopią wykazali Kukkonen i wsp. (2007) oraz Moro i wsp. (2006), którzy stosowali probiotyki i galaktooligosacharydy u dzieci w pierwszym półroczu życia. U dzieci z AZS i cechami atopii podawanie Lactobacillus rhamnosus GG w dawce powyżej 1010 w innym badaniu (Pessi i wsp.,2000) okazało się również bardzo korzystne, co znalazło wyraz w zwiększonej aktywności Il-10. W badaniach przeprowadzonych u 511 zdrowych dzieci fińskich w wieku 1 – 6 lat uczęszczających do żłobków i przedszkoli, które otrzymywały Lactobacillus GG, wykazano również mniejszą częstość występowania zakażeń górnych dróg oddechowych (Hatakka i wsp., 2001), co sugeruje celowość tego rodzaju profilaktyki.

Ochronne działanie prewencyjne probiotyków w chorobach alergicznych najprawdopodobniej uwarunkowane jest syntezą przeciwciał IgA, stymulowaną przez limfocyty Th1 oraz syntezą transformującego czynnika wzrostu TGF-beta, hamującego produkcję limfocytów Th2. Mimo wielu badań potwierdzających bezpieczne przeciwzapalne i immunomodulacyjne działanie probiotyków u człowieka, pojawiają się również sygnały o grupach zwiększonego ryzyka, m.in. wcześniaki i stany zaburzeń odporności (Agostoni i wsp., 2004). Rozwój zakażenia obserwowano, np. na oddziałach onkologicznych, kardiochirurgicznych i intensywnej terapii (Muszyński i wsp., 2007). Rozwój zakażenia p.p., przy udziale Lactobacillus rhamnosus i Lactobacillus casei opisali Cannon i wsp. (2005) oraz Salminen i wsp. (2006). W badaniach randomizowanych z podwójnie ślepą próbą kontrolowaną placebo wykazano także wzrost śmiertelności u chorych z ostrym zapaleniem trzustki otrzymujących probiotyki (Besselink i wsp., 2008). Wskazuje się również na możliwość wystąpienia niepożądanych reakcji immunologicznych lub przenoszenia oporności na antybiotyki.

Dotychczasowe spostrzeżenia o pozytywnych efektach działania immunomodulacyjnego i przeciwalergicznego probiotyków wymagają potwierdzenia w kolejnych prawidłowo zaplanowanych badaniach, wykonanych w różnych zespołach badawczych, wyłącznie w odniesieniu do pojedynczego szczepu ze ścisłym określeniem dawkowania.

Podsumowanie i wnioski
Drobnoustroje probiotyczne mają istotny udział w rozwoju i dojrzewaniu układu limfoidalnego jelita (GALT) oraz wykazują pozytywne oddziaływanie w stanach alergii, szczególnie w atopowym zapaleniu skóry (AZS) u dzieci.

Potwierdzonego efektu terapeutycznego lub profilaktycznego jednego szczepu probiotycznego nie można przenosić na inne, wykazano bowiem znaczne zróżnicowanie ich oddziaływania immunologicznego. Podobnie, pozytywne wyniki uzyskane u zwierząt nie upoważniają do takiego wnioskowania u ludzi.